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兔抗鼠血清的應用

日期:2022-08-18 03:04
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摘要:兔抗鼠血清的應用應用[4][5] 用于FcγRⅡb在小鼠抗病毒免疫中的作用研究 以鼠FcγRⅡb的胞外域去除信號肽部分的基因序列為模板,設計特異性引物。以鼠肺泡巨噬細胞總RNA反轉錄的cDNA為模板,用PCR方法,擴增FcγRⅡb胞外域目的片段,得到長度為555bp的目的片段。將回收的FcγRⅡb胞外域片段連接到pET-28a載體中,經鑒定測序正確后命名為pET-28a-FcγRⅡb。之后將其轉化到BL21(DE3)菌株中進行表達,用摸索的*佳條件大量誘導表達FcγRⅡb胞外域蛋白,用摸索的*佳尿素濃度純化蛋白,純化的FcγRⅡb蛋白測過含量后分裝,-40℃保存。
兔抗鼠血清的應用
背景[1-3]
兔抗鼠血清是將鼠IGG抗原分子分別以弗氏完全佐劑(油包水溶性抗原分子)或弗氏不完全佐劑,及水劑相結合的劑型免疫注射于兔子等實驗動物的不同部位,產生高效價抗體后,經無菌低溫分離制成。免疫血清可廣泛的應用于醫學、生物學的各個學科,特別在臨床免疫測定和免疫病理的診斷中更是必備之材。

這里提供的抗血清產品經過脂類抽提以提高透明度,經去鹽和透析處理以去除包含疊氮化鈉的磷酸緩沖液,并*后凍干以獲得凍干粉末。其中針對全血清蛋白的抗血清是通過完整血清免疫宿主動物獲得,而針對所有IgG分子的抗血清則可與PAP聯用。

兔抗鼠血清
抗原的免疫方案根據其性質不同而異以制備兔抗鼠IGG抗血清為例:
(1)抗原乳化:稱取羊毛脂10g于研缽中,、逐滴加入石臘油40ml,逐滴研磨,高壓滅-菌后備用。將上述不完全福氏佐劑預熱至60℃,取3ml,逐滴加入0.5ml BCG(75mg/ml),繼續加入2.5ml人C3蛋白(2.4mg/ml),邊滴入邊研磨,直至達到“油包水”狀態。
(2)動物免疫:選取健康新西蘭兔(3Kg左右),消-毒局部皮膚,用1ml注射器吸取1ml乳化抗原,于兔每只腳掌皮下注入0.5ml。間隔2周后,將1ml乳化抗原多點(5-10點)注入兔腘窩及背部皮下。間隔2周后,在1周內分別3次通過兔耳靜脈注射2.4mg/ml人C3蛋白液(分別為0.1ml、0.3ml、0.5ml),間隔1周后采用雙向免疫擴散測定抗血清效價,當效價達到1:16以上即可放血。
(3)放血:可采用頸動脈放血法和心臟采血法。
(4)鑒定:采用雙向免疫擴散或ELISA測定抗血清效價。
(5)保存:抗血清收獲后,加1/萬硫柳汞或1/萬的疊氮鈉防腐,或加入等量的中性甘油,分裝小瓶,置-20℃以下的低溫保存,數月至數年內抗體效價無明顯變化。注意避免反復凍融。也可將抗血清冷凍干燥后保存。

兔抗鼠血清的應用[4][5]
用于FcγRⅡb在小鼠抗病毒免疫中的作用研究
以鼠FcγRⅡb的胞外域去除信號肽部分的基因序列為模板,設計特異性引物。以鼠肺泡巨噬細胞總RNA反轉錄的cDNA為模板,用PCR方法,擴增FcγRⅡb胞外域目的片段,得到長度為555bp的目的片段。將回收的FcγRⅡb胞外域片段連接到pET-28a載體中,經鑒定測序正確后命名為pET-28a-FcγRⅡb。之后將其轉化到BL21(DE3)菌株中進行表達,用摸索的*佳條件大量誘導表達FcγRⅡb胞外域蛋白,用摸索的*佳尿素濃度純化蛋白,純化的FcγRⅡb蛋白測過含量后分裝,-40℃保存。

將純化的FcγRⅡb胞外域蛋白與弗氏佐劑按1:1.2的比例制成免疫原,按1mg/kg免疫新西蘭大白兔,經ELISA方法檢測,兔抗鼠FcγRⅡb血清效價達到為1:12800時大量采血收集血清。經Western blot檢測,兔抗鼠FcγRⅡb抗體具有很強的特異性。用過硫酸銨粗提和ProteinG Sapharose 4xFast Flow柱子純化兔抗鼠FcγRⅡb IgG。純化后兔抗鼠FcγRⅡb IgG經ELISA檢測其效價達到1:25600。激活FcγRⅡb后鼠腹腔巨噬細胞中天然免疫相關細胞因子的變化規律將從健康小白鼠腹腔中灌洗得到的鼠腹腔巨噬細胞用含10%血清的RPMI-1640培養基稀釋到106個/mL,每孔500μL在24孔細胞培養板中培養,將純化的兔抗鼠FcγRⅡb IgG和兔陰性IgG稀釋到500μg/mL,激活組和陰性對照組每孔加入200uL稀釋后的IgG,處理鼠腹腔巨噬細胞。

分別在處理鼠腹腔巨噬細胞后的12、24、36、48h收取各孔中的細胞,提取總RNA并反轉錄成cDNA。采用RT-qPCR方法檢測天然免疫相關細胞因子IRF3、IFN-αIFN-β、IFN-γ、TNF-α、1L-1β、TGF-βmRNA水平,結果顯示,激活FcγRⅡb在12-48h上調巨噬細胞中干擾素調節因子IRF3,干擾素IFN-α、IFN-β、IFN-γ,炎性因子TNF-α、IL-1β,和Toll樣受體TLR3的mRNA水平,下調免疫抑制因子TGF-βmRNA水平。說明鼠FcγRⅡb的激活能上調巨噬細胞的天然免疫能力。

激活FcγRⅡb在鼠腹腔巨噬細胞在抗病毒免疫中的作用將從健康小白鼠腹腔中灌洗得到的鼠腹腔巨噬細用含10%血清的RPMI-1640培養基稀釋到106個/mL,每孔500μL在24孔細胞培養板中培養,將純化的兔抗鼠FcγRⅡb IgG和兔陰性IgG稀釋到500μg/mL,每孔200μL處理鼠腹腔巨噬細胞,作用2h后棄去上清,然后接種MHV,培養2h后將其棄去并補加維持液。

分別在補加病毒維持液后的12、24、36、48h時,收取各孔細胞并提取總RNA反轉錄成cDNA,采用RT-qPCR方法測定MHV的拷貝數和天然免疫相關細胞因子的mRNA水平。結果顯示,FcγRⅡb IgG-MHV試驗組與兔陰性IgG-MHV組和MHV組相比,FcγRⅡb的激活仍能上調巨噬細胞中干擾素調節因子IRF3,干擾素IFN-αIFN-β、IFN-γ,炎性因子TNF-α、IL-1β和TLR3的mRNA水平,下調免疫抑制因子TGF-βmRNA水平,而且FcγRⅡb IgG-MHV試驗組病毒拷貝數在24-48h低于陰性IgG-MHV對照組和MHV對照組。
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